产品中心
您现在所在位置:首页 > 产品中心 > > 遗传毒性检测试剂 > TK基因突变试剂盒

TK基因突变试剂盒

更新时间:2020-06-29
产品型号:TK-v1.0
所属分类:遗传毒性检测试剂
描述:TK基因突变试剂盒针对小鼠淋巴瘤细胞L5178Y开展TK基因突变试验,剂盒省去阳性底物成分、筛选培养基准备、诱导 S9 制备,可以直接使用,大大缩短了实验周期;试剂盒各成分均经过严格的质量检测,无杂菌污染,诱导 S9 活性均符合小鼠淋巴瘤细胞TK基因突变试验要求,实验结果准确、可靠、重现性高。
详情介绍

TK基因突变试验
TK基因突变试验的检测终点是TK基因的突变。TK基因突变属于常染色体基因突变。TK基因的产物胸苷激酶在体内催化从脱氧胸苷(TdR)生成胸苷酸(TMP)的反应。在正常情况下,此反应并非生命所必需,原因是体内的TMP主要来自于脱氧尿嘧啶核苷酸(dUMP),即由胸苷酸合成酶催化的dUMP甲基化反应生成TMP。但如在细胞培养物中加入胸苷类似物(如三氟胸苷,即trifluorothymidine,TFT),则TFT在胸苷激酶的催化下可生成三氟胸苷酸,进而掺入DNA,造成致死性突变,故细胞不能存活。若TK基因发生突变,导致胸苷激酶缺陷,则TFT不能磷酸化,亦不能掺DNA,故突变细胞在含有TFT的培养基中能够生长,即表现出对TFT的抗性。根据突变集落形成数可计算突变频率,从而推断受试物的致突变性。在TK基因突变试验结果观察中可发现两类明显不同集落,即大/小集落(L5178Y细胞)或正常生长/缓慢生长集落(TK6细胞),有研究表明,大集落/正常生长集落主要由点突变或较小范围的缺失等引起,而小集落/缓慢生长集落主要由较大范围的染色体畸变,或由涉及调控细胞增殖的基因缺失引起。

TK基因突变试剂盒
北京汇智泰康医药技术有限公司针对小鼠淋巴瘤细胞TK基因突变试验开发染TK基因突变试剂盒,本试剂盒针对小鼠淋巴瘤细胞L5178Y开展TK基因突变试验,试剂盒省去了阳性底物成分、筛选培养基准备、诱导 S9 制备,可以直接使用,大大缩短了实验周期;试剂盒各成分均经过严格的质量检测,无杂菌污染,诱导 S9 活性均符合小鼠淋巴瘤细胞TK基因突变试验要求,实验结果准确、可靠、重现性高。试剂盒应用广泛,可进行食品、化学品、农药、消毒剂、食品添加剂、药物残留、化妆品、容器与包装材料等多个方面的遗传毒理学检测。

便捷—— 本试剂盒省去了诱导 S9 制备,阳性底物、筛选培养基的配制和浓度条件摸索的时间,可以直接使用,大大缩短了实验周期。
准确——本试剂盒各成分均经过严格的质量检测,无杂菌污染,诱导 S9 活性均符合L5178Y细胞基因突变试验要求,实验结果准确、可靠、重现性高。
稳定—— 本试剂盒稳定性强、易于运输和保存。

【试验原理】
TK基因突变试验的检测终点是TK基因的突变。在细胞培养物中加入三氟胸苷(TFT),则TFT在胸苷激酶的催化下生成三氟胸苷酸,进而参入DNA,造成致死性突变,细胞不能存活;若TK基因发生突变,导致细胞胸苷激酶(TK)缺陷,则TFT不能磷酸化,亦不能掺入DNA,突变细胞表现出对TFT抗性,在TFT存在条件下仍能生长。在有或无代谢活化的条件下,将细胞培养物暴露于受试物适当时间,经适当的培养时间,计数集落,计算突变频率,从而推断受试物致突变性。
【产品说明】
本试剂盒提供进行体外哺乳动物细胞TK基因突变试验所需的主要试剂和细胞,可用于评价受试物的致突变作用。其中所用细胞和试剂均符合国标要求,且在国标的基础上引入了MTT染色法,使的结果观察更为直观,为实验结果的可靠性提供了支持。

产品组分规格数量使用说明保存条件
细胞(L5178Y)1mL1/-70℃
THMG(100×)0.5mL1使用前混匀
THG(100×)0.5mL1使用前混匀
S9复合物5.0mL1冰浴融化并混匀
环磷酰胺(CP)0.5mL1800 μg/mL,使用前混匀
三氟胸苷(10002mL13 mg/mL,使用前混匀
磷酸盐缓冲液60mL1使用前混匀室温
加基皇酸甲酯(MMS)0.5mL11.5 mg/mL,使用前混匀
染色剂MTT70mL21 mg/mL,使用时
10μL/孔加入96孔板中

【产品使用说明】
1、细胞复苏
从-70冰箱取出细胞,于37℃水浴融化,1000rpm离心5min,弃上清,用含10%马血清、0.2mg/mL一同酸钠的RPMI 1640培养液(RPMI-10)中重悬细胞;1000rpm再次离心5min,弃上清,用RPMI-10重悬后接种于细胞瓶中培养。
2、自发突变细胞清除
取对数生长期细胞悬液,于含1% 的THMG(100×)的完全培养基中培养24 h,1000 r/min离心5 min,洗涤后于含1%的THG(100×)完全培养基中继续培养2 d。
注:为确保试验的可行性,试验中所用细胞的自发突变率应在5010-6~20010-6之间,清除自发突变的细胞传代使用不得超过1个月,每次试验前需将细胞清除自发突变。
3、染毒处理
取生长良好的细胞,调整细胞密度为5×105个/mL(细胞数可根据实验室情况做调整),在加或不加代谢活化系统的条件下,按1%的体积加入不同浓度的受试物,37℃,70 rpm/min染毒处理3h,每个试验组平行处理两份培养物。
(1)S9混合液及染毒用细胞液配制

S9混合液配制(30mL)
S9复合物4.8mL现配现用。使用过程中,于冰浴条件下保存。
试验结束后,剩余溶液应丢弃,不可重复使用。
磷酸盐缓冲液25.2mL
活化条件下染毒用细胞悬液配制(19.8 mL/体系,共12个体系)
细胞悬液120mL混合均匀后,19.8 mL/管分装于50mL无菌离心管或细胞培养瓶中,备用。
RPMI-10培养液93.6mL
S9混合液24mL
非活化条件下染毒用细胞悬液配制(19.8 mL/体系,共12个体系)
细胞悬液120mL混合均匀后,19.8 mL/管分装于50mL无菌离心管或细胞培养瓶中,备用。
RPMI-10培养液93.6mL
磷酸盐缓冲液24mL

注:在试验过程中,需根据实际需求,调整配制量。
(2)推荐染毒培养体系配制方案(以4个受试物剂量组为例)

处理方式组别染毒用细胞液体积(mL)受试物体积(mL)溶剂体积(mL)阳性对照体积(mL)
CPMMS
活化阳性对照19.8//0.2/
剂量119.80.2///
剂量219.80.2///
剂量319.80.2///
剂量419.80.2///
溶剂对照19.8/0.2//
不活化阳性对照19.8///0.2
剂量119.80.2///
剂量219.80.2///
剂量319.80.2///
剂量419.80.2///
溶剂对照19.8/0.2//

注:染毒时间可根据实际情况进行调整,一般为3h~6h,必要时可延长到1个或多个细胞周期。若需进行24小时染毒,所用阳性底物需稀释3倍后再加入。
4、表达培养
染毒细胞经离心洗涤后,重悬细于RPMI-10培养液中,于在细胞培养瓶中表达培养2 d。每天测定细胞密度,计算悬浮生长(SG)、相对悬浮生长(RSG)和细胞相对总生长(RTG),具体方法可参照国标方法要求。
5、突变频率测定
表达培养2天后,用含20%马血清、0.2mg/mL内容酸钠的RPMI 1640培养液(RPMI-20)重悬细胞,调整细胞密度为1×104个/mL,加入TFT(终浓度3 μg/mL),混匀,0.2mL/孔接种96孔板(即2000个细胞/孔),于37℃、5% 二氧化碳的培养箱中培养12 d,10μL/孔加入MTT染色剂,继续于培养箱中放置2~4h,计数每块平板有大集落LC和小集落SC生长的孔数。试验样品处理组和阳性对照组每份培养物各设2个重复;阴性溶媒对照组设4个重复。
6、数据处理和结果评价
数据处理方法和结果判定可参照:476 体外哺乳动物细胞基因突变试验,化学品测试方法健康效应卷(第二版),中国环境出版社,2013年(ISBN:978-7-5111-1476-1);OECD 490等。
注:在染毒处理和表达培养结束后,均需对平板接种效率进行测定,且要保证PE在70%~130之间,具体可参照国标方法进行。
【注意事项】
1.实验前请自行准备RPMI 1640培养液、马血清、冰统酸钠、细胞培养瓶、96孔细胞培养板、灭菌枪头、无菌移液管、二氧化碳培养箱、振荡器、50mL离心管等,所有耗材需做无菌处理。
2.实验操作应在符合细胞培养实验要求的环境下进行。
3.细胞清除自发的突变使用的血清建议与正式试验血清同一厂家同一批号。
4.实验过程中注意细胞计数的准确性。

 

 

留言框

  • 产品:

  • 留言内容:

  • 您的单位:

  • 您的姓名:

  • 联系电话:

  • 常用邮箱:

  • 详细地址:

  • 省份:

  • 验证码:

    请输入计算结果(填写阿拉伯数字),如:三加四=7


北京汇智泰康医药技术有限公司(www.iphasepruducts.com)版权所有 © 2020

邮箱:support@iphasebio.com

地址:北京市北京经济技术开发区科创十四街99号十八号楼1832室

管理登陆  技术支持:化工仪器网  GoogleSitemap

在线客服 联系方式 二维码

服务热线

13811120435

扫一扫,关注我们