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细胞色素P450酶系体外药物代谢研究方法进展

 发布时间:2020-07-07 点击量:129

细胞色素P450酶系体外药物代谢研究方法进展

来源:中国药事2013年第27卷第1期

作者:于敏,张双庆,闻镍,李佐刚

中国食品药品检定研究院食品药品安全评价研究所

 

摘要

目的:综述细胞色素P450(CYP450)酶影响药物代谢的体外研究方法。

方法:参考国内外文献,对与药物代谢相关的CYP酶亚型、CYP酶种属差异、CYP酶体外反应体系、药物主要代谢酶的确认方法及体外CYP酶的抑制和诱导,进行分类、归纳和整理。

结果与结论:CYP450在药物代谢中具有重要作用,药物代谢研究是新药评价体系中重要的一部分。

 

关键词

细胞色素P450酶;药物代谢;药物相互作用;体外研究

 

药物进入机体后主要以两种方式被清除:一种是药物不经任何代谢而直接以原型形式排出体外;另一种是部分药物在体内经代谢后,再以原型和代谢物的形式排出体外。当药物主要通过代谢被清除时,代谢途径可显著影响药物的安全性、疗效及用法。

药物的代谢,也称为生物转化,在体内主要有两个步骤:第1步称为Ⅰ相代谢反应,药物在这相反应中被氧化、还原或水解;催化Ⅰ相反应的酶主要为肝微粒体中的细胞色素P450酶(CytochromeP450,CYP450)。

第二步称为Ⅱ相代谢反应,药物在这一相反应中与一些内源性的物质(如葡萄糖醛酸、甘氨酸、硫酸等)结合或经甲基化、乙酰化后排出体外;催化Ⅱ相反应的酶有许多,其中主要的有葡萄糖醛酸转移酶、谷胱甘肽-S-转移酶、磺基转移酶和乙酰基转移酶等。

在上述的代谢反应中,由P450酶所催化的Ⅰ相反应是药物在体内代谢转化的关键性步骤,因为这一步反应常常是药物从体内被清除的限速步骤,它可以影响到药物许多重要的药动学特性,如药物的半衰期、清除率和生物利用度等[1];此外,若药物通过单个代谢途径被清除,则代谢速率的个体差异可导致血液和组织中的药物和代谢产物浓度出现巨大差异。

 

1细胞色素P450酶

细胞色素P450酶,是一种以铁卟啉为辅基的蛋白质,不仅分布于肝脏,小肠和肾脏也有表达,由血红素蛋白(P450)、黄素蛋白(NADPH-细胞色素C还原酶)及磷脂三部分组成,相对分子质量为45000~55000Da。P450酶系由Klingberg和Gorfinkle在1958年发现的,由于它在还原状态下可以与CO结合,并在波长为450nm 时有最大吸收峰,因此而得名[2]。该酶有许多同工酶,故称细胞色素P450酶系,简称为CYP450S。CYP450S的命名方法:第1个数字表示族,第二个英文字母表示亚族,第三个数字表示某种特定的酶, 如CYP2D6[3]。

CYP450S的分类:CYP450S是一组由许多同工酶组成的超基因大家庭,随着分子生物技术的发展和人类基因组计划的完成,人类编码CYP450S的基因已基本明确,由18个基因家族,43个亚家族,57个基因,59个假基因组成。

在人类肝脏各种代谢酶中,CYP3A4、CYP2C、CYP1A2和CYP2E1分别占29%,17%,12% 和6%,CYP2A6 占4%,CYP2D6占1%[4]。虽然有18个基因家族,但是大约95%的药物氧化作用由6种CYP酶催化执行,其中CYP3A4占35%,CYP2D6占15%,CYP1A2占12%,CYP2C9占9%,CYP2C19占8%,CYP2B6和CYP2E1均占6%,CYP2A6占3%[5]。

 

该酶系具有以下几方面的生物学特性:

(1)P450酶是一个多功能的酶系,可以催化60种以上的代谢反应,它可作为单加氧酶、脱氢酶、还原酶、过氧化酶、酯酶等而催化代谢反应,因此P450酶可以催化一种底物同时产生几种不同的代谢物;

(2)P450酶对底物结构的特异性不强,可代谢各种类型化学结构的底物,每一种P450酶都有广泛的底物,既能代谢大分子底物,也能代谢小分子的底物;

(3)P450酶存在有明显的种属、性别和年龄差异。

其中以种属差异表现最-为明显,不同种属的P450同工酶组成不同,因此药物在不同种属动物和人体内的代谢途径及代谢产物可能不同。这是由于P450在不同种属中基因表达上的差异所造成的,P450酶在不同种属的动物和人体内的表达有质和量的差异,因此不同种属动物和人体内的P450酶底物和产物特异性及P450酶活性可以不同。这是造成代谢种属差异的主要原因,因此我们不能完全用动物P450酶来代替人的P450酶进行研究,具体的CYP酶亚型见表1。

 

P450酶的性别差异在大鼠体内表现最-为明显,现已发现雌雄大鼠体内P450同工酶的组成有明显的质和量的差异,某些药物在雌、雄大鼠体内的主要代谢途径和代谢产物可能是不同的,因而造成其在雌雄大鼠体内的毒性也存在明显的差异,这值得引起临床前药动学和毒理学研究的重视。

P450酶在年龄上的差异主要表现在酶量和活性方面[6];

(4)P450酶具有多型性,它是一个超级大家族,每种哺乳动物至少有30种以上的P450酶,由此可见P450酶系是由多种类型的P450酶所组成的一个庞大家族;

(5)P450 酶具有多态性(PolymorPhism),即同一种属的不同个体间某些P450酶的活性存在较大差异,可将个体按代谢速度的快慢分为四种表型:弱代谢型(PMs)是缺乏功能酶,中等代谢型(IMs)是等位基因缺失杂合子,强代谢型(EMs)是携带两个功能基因拷贝,和超强代谢型(UMs)是携带两个以上功能基因拷贝。

现已发现在人肝P450 酶中,CYP1A1-3、CYP2C8-9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A3-4均表现出明显的多态性,其中以CYP2D6和CYP2C19的多态性最-为典型,如由CYP2C19参与的S-美芬妥因的羟化代谢就表现出典型的多态性,即不同个体对S-美芬妥因的羟化代谢速度存在非常显著的差异,按代谢速度可以将人群分为两种类型,即PMs 和EMs,前者的血药浓度明显高于后者,PMs的AUC值(药-时曲线下面积)显著升高,消除半衰期明显延长。

P450酶的多态性主要是由于其基因缺陷所致,这种基因缺陷可能是由于遗传变异所造成的。

P450酶的多态性不仅表现在同一种属的不同个体间,同时不同种族间的代谢缺陷发生率也存在显著差异,如CYP2D6在不同种族中的PMs的发生率就存在明显的种族差异,黄种人对异喹胍的代谢缺陷(即PMs)发生率为1%左右,黑人的代谢缺陷发生率为0%~2%,而白种人的代谢缺陷发生率高达5%~10%[7]。

(6)P450酶具有可诱导性和可抑制性。

一方面包括药物在内的很多化学异物可对P450酶产生诱导作用,使某些P450酶的量和活性明显增加。

人们较早发现了这一现象,其中最典型的例子就是苯-巴比妥可以诱导肝P450酶,从而加速其自身的代谢,使其镇静、催眠作用减弱。

另一方面,许多外源性的化学异物包括许多药物可以选择性地抑制某些P450酶,使其活性明显降低,因而可以抑制其对其他化学异物的代谢[8]。

 

2细胞色素P450酶系药物代谢研究方法

2.1 所需材料和仪器

受试药物,混合肝微粒体,磷酸钾缓冲液(PH7.4,50~100mmol·L-1),NADPH再生系统(汇智泰康NADPH再生系统,包括Solution A和SolutionB两种试剂,临用混合,A试剂含有31mMNADP+、66mMG-6-P和66mMMgCl2,B试剂含有40U·mL-1G-6-PDH,其再生原理为G-6-PDH 催化G-6-P脱氢,并将NADP+转化为NADPH,其中Mg2+ 是G-6-PDH 催化反应所必需的辅助因子)或者市售的NADPH 和MgCl2,LC-MS/MS,离心机,37°C水浴摇床,超低温冰箱。

2.2 所需溶液的配制

反应缓冲液(50mmol· L-1PH7.4汇智泰-康磷酸盐缓冲液),反应启动液(Solution A和SolutionB临用前4°C过夜解冻,置冰浴中,按5∶1 (v/v)混合,再加入反应缓冲液稀释至NADP+含量约为1mmol·L-1后使用)/ (1mmol·L-1NADPH 溶液和5mmol·L-1MgCl2),反应终止液(冰冷的内标甲醇溶液,-20°C储存,加入3倍体积终止反应),肝微粒体(汇-智泰康可提供猴肝微粒体,大鼠肝微粒体,小鼠肝微粒体等)溶液(-70°C取出后37°C水浴1min快速解冻,然后迅速转移至冰浴中用反应缓冲液稀释至0.2mg·mL-1,不可反复冻融),受试药物储备液及工作液,内标溶液。

2.3 建立反应体系

(1)NADPH溶液、微粒体溶液、受试药物工作液和反应缓冲液放入37°C水浴中,50rPm下恒温5min;(2)取不同摩尔浓度的受试药物工作液150μL,加入0.2mg·mL-1的微粒体溶液60μL,不建议涡旋混匀,加入反应启动液NADPH 再生系统90μL混匀后开始计时;(3)分别于孵育不同时间取出20μL孵育液,转移到冰浴上,加入3倍体积反应终止液终止反应,涡旋,离心,取上清液10μLLC-MS/MS进样分析[9];(4)根据实验结果,优化孵育时间、底物浓度、微粒体蛋白浓度。

2.4 反应体系注意事项

2.4反应体系注意事项

(1)体外孵育条件:缓冲体系的选择,缓冲体系的离子强度,孵育环境PH 值,孵育时间和微粒体蛋白浓度都会影响酶促反应的代谢速度。

底物浓度应当过量,大于酶最适底物浓度约10倍,且反应消耗量应当<20%。

(2)有机溶剂的影响:由于许多P450酶底物和抑制剂都是强疏水性化合物,建立水性反应体系时,不可避免会用到甲醇、乙醇、乙腈和二甲基亚砜(DMSO)等有机溶剂。

但是,有机溶剂会影响天然酶反应环境和酶活性,从而改变酶-底物相互作用,因此,有机溶剂的浓度要求<1% (v/v),最-好<0.1%。

(3)非特异性微粒体结合:因为大部分药物都是脂溶性有机化合物,会与微粒体膜上的脂质蛋白产生非特异性结合,使得游离的底物浓度小于添加浓度。

会出现基于添加浓度的表观Km值(米氏常数,即药物在体内的消除速度为Vm的一半时所对应的血药浓度)高于真实Km,但其不影响Vmax值,导致高估了Km值而低估了体内药物清除率(CL)。

因此,应当优化微粒体蛋白浓度,选用可定量代谢物的最低蛋白浓度,使非特异性蛋白结合最小化。

2.5 数据分析

2.5.1 典型酶促动力学

典型的CYP介导的酶促反应动力学符合米氏方程(公式1)特征,拟合动力学曲线,计算酶促动力学参数Vmax和Km,其中v 是反应速度, [S]是底物浓度,Vmax是最大反应速度,Km是米氏常数———表示达到最大反应速度一半时的底物浓度。

从反应式1得出Km是反映速度的常数,Km= k-1+k2/k1。

有报道称Km是反映底物对酶的亲和性,此说法是不正确的[10]。

因v=CLint· [S],将米氏方程转换得到公式2,通过Vmax和Km值可以计算得到药物的体外固有清除率,将体外清除率(CLint)外推得到该药物的体内CLint。

2.5.2 动力学曲线

通过拟合动力学曲线,可以快速求出参数值,而且可以初步判断有无酶抑制现象或者是否是非典型酶促动力学。

2.5.2.1 Lineweaver-Burk 作图

以1/v为y轴,1/ [S]为x轴作图,得到一条直线,直线的斜率即Km/v,y轴截距是1/Vmax,x轴截距是-1/Km。

此作图方法是用的计算酶促动力学参数的方法,但其会夸大底物浓度低时的错误,故常用于初期参数评价,而不常用于最终参数确定。

2.5.2.2 Hanes-Woolf 作图

以[S]/v为y轴,[S]为x轴作图,得到一条直线,直线的斜率即1/Vmax,y轴截距是Km/Vmax,x轴截距是-Km。

与前种方法比较,此作图方法错误概率小且恒定,是确定酶促动力学参数更好的选择。

2.5.2.3 Eadie-Hofstee 作图

以v为y轴,v/ [S]为x轴作图,得到一条直线,直线的斜率即-Km,y轴截距是Vmax,x轴截距是Vmax/Km。

此作图方法因x轴是速度,是一个变量,会引入更多的实验误差。值得关注的是,根据此作图方法拟合曲线的形状可以判断非典型酶促动力学的类型。

2.5.3 非典型酶促动力学

大部分CYP酶介导的药物代谢反应符合典型酶促动力学的双曲线模型,但是一些P450酶会呈非典型酶促动力学,是由于酶和底物分子具有多个结合位点造成动力学行为的改变。

非典型酶促动力学有四种模型:反曲线同向协同(HomotroPicCooPerativity:SigmoidalKinetics),二段式同向协同(HomotroPicCooPerativity:BiPhasicKinetics),底物抑制动力学和异向协同(HeterotroPicCooPerativity)。

同向协同是两个相同的底物分子协同作用的结果,异向协同是两个结构上完全不同的底物分子协同作用的结果。

2.5.4 酶抑制动力学

此效应是缘于抑制剂效应分子的存在,使得酶被抑制,底物反应速度下降。

通过体外酶抑制动力学可以预测可能存在的药物-药物相互作用。

其中对酶的抑制作用按机理分为可逆性,半可逆性和不可逆性三类。

不可逆性抑制是抑制剂(也可称灭活剂Inactivator)和酶形成的结合物被酶激活后不可逆地使酶失去活性,其呈现时间依赖性,往往抑制剂从体内清除后其抑制作用还会存在一段时间。

可逆性抑制(ReversibleInhibitor)包括三种:竞争性抑制(ComPetitiveInhibition),非竞争性抑制(NoncomPetitiveInhibition) 和反竞争性抑制(UncomPetitiveInhibition)。

竞争性抑制是简单见的类型,是抑制剂与底物竞争游离酶的结合部位,对反应的Vmax不产生影响,会增加Km值,可以用公式3来表示。

非竞争性抑制比较少见,是抑制剂与底物可逆性地结合,对Km不产生影响,会降低Vmax,通常认为混合抑制的初期表现为此抑制现象。

反竞争性抑制是抑制剂只与酶-底物复合物结合,而不与游离酶结合,使得Km和Vmax都变小,但Vmax/Km比值不变,可以用公式4来表示。

此外,还有混合抑制(MixedInhibition),表现为Vmax降低,Km增高,由于多种结合机制造成,抑制剂可与底物竞争游离酶的结合部位,抑制剂先结合酶分子再与底物结合,抑制剂还可结合酶-底物复合物。

IC50和Ki通常用来表示一个化合物的抑制能力,但两者不等同。

Ki= [E][I]/ [EI],由多个底物浓度(通常3~4种)和多个抑制剂浓度(通常4~5种)确定;IC50是由一个底物浓度和多个抑制剂浓度确定。

IC50表示底物代谢被抑制50%时的抑制剂浓度,Ki是酶-抑制剂复合物的解离常数。

IC50与底物浓度以及酶浓度相关,Ki值与此类因素无关,故只有在相同底物浓度和相同酶浓度时IC50值才可以相互比较,而不同底物的Ki值可以相互比较。

此外,当底物浓度非常接近Km值时,IC50/2等于Ki。

3确定受试药物的代谢途径和主要代谢产物

代谢途径鉴定实验,是将药物和不同种系(汇智泰康不同种系肝微粒体,大鼠肝微粒体,比格犬肝微粒体,小鼠人肝微粒体,人肝微粒体等)的混合肝微粒体一起孵育,或用肝细胞或者肝脏部分组织培养药物,然后通过HPLC-MS/MS分析孵育介质或培养基和细胞内容物,可以大致确定该药物是否是肝微粒体P450酶的底物,可以直接获得氧化、水解或基团转移形成的代谢物,提供平行代谢还是先后代谢的信息,以及主要代谢途径和代谢产物可能存在的种属差异。

 

此项分析需要借助代谢物谱预测筛查软件进行。

4药物代谢酶的确认并注意CYP酶的种属差异

如果CYP酶对药物的代谢量大于药物总清除率的25%,则应当进行CYP酶鉴定研究,也称为反应表型研究[11]。

利用下述3种方法确认不同的CYP酶对药物代谢的贡献。

4.1 计算机辅助设计对接预测

根据蛋白质数据库(ProteinDataBank)提供的信息得到CYP450酶亚型的晶体结构。

药物-CYP450蛋白空间模拟对接时,主要基于空间位置上邻近CYP450蛋白中血红素和铁氧离子的底物识别位点而进行。

运用软件的对接程序,通过渐进式构造算法来计算优化配基与底物识别位点间的相互作用,通过氢键和疏水作用的加合来计算自由能,进而利用软件的评分功能将计算所得的自由能数值求和后按照从小到大的顺序排序。

4.2 特定的化学物质或抗体作为特异性酶抑制剂

大部分化学抑制剂对各个CYP酶均无绝对特异性,表2列出了实验可选用的特异性化学抑制剂[12]。

药物的浓度要≤ Km值,尽可能在初始比率条件下(代谢产物产生速率与时间和酶浓度呈线性)进行实验。

抑制剂均用甲醇溶解,采用一系列浓度。

当使用基于作用机制的抑制剂(Mechanism-BasedInhibitor)时,将抑制剂与酶预先孵育15~30min。同时,还应注意同一抑制剂对不同种属同一CYP酶的灵敏度不同。

选择足够低和足够高的抗体浓度来对抑制抗体的抑制作用进行试验,以确定滴度曲线。

4.3 应用不同的重组CYP酶

这种技术对研究单个CYP酶在整个药物代谢中的相对贡献的大小具有很高的价值,但不能代表人肝微粒体在体外的绝对代谢比率。

重组酶孵育体系与肝微粒体相似,除CYP2A6和CYP2C9的反应介质为Tris缓冲液(PH7.5)外,其他酶的介质均为磷酸钾缓冲液(PH7.4)。

5确定受试药物是否是肝微粒体P450酶的抑制剂

5.1 实验设计注意事项

(1)将药物与合适的探针底物[12] (见表3)和相应的CYP450酶共培养。

(2)测定IC50时,在底物代谢率允许的情况下,尽量使底物浓度低于Km值,使IC50与Ki值更具相关性。

(3)肝微粒体蛋白浓度通常<1mg·mL-1。

(4)缓冲液的性质、PH 对Vmax和Km会有影响,尽可能采用标准化分析条件。

(5)反应系统中控制底物或抑制剂的消耗不超过10%~30%,但是对于Km值很低的药物来说,控制反应体系底物消耗<10%很困难。

(6)建议时间-产物形成量呈线性关系。

(7)建议酶量-产物形成量呈线性关系。

(8)所有溶剂的浓度都要<1% (v/v),最-好<0.1%,同时设立无溶剂对照。

(9)实验设立一个已知抑制剂的阳性对照(见“4.2”项下)。

(10)结果分析,确定受试药物是否是可逆性抑制剂,是否是基于作用机制抑制剂[11]。

5.2 确定受试药物是否是可逆性抑制剂

理论上,抑制剂在作用部位的浓度与底物的Ki值相当或超过Ki时会产生明显的抑制效应。相互作用程度(以R表示,代表底物AUC改变的倍数)可以通过R=1+ [I]/Ki进行评估,[I]是酶活性部位暴露的抑制剂浓度,代表了给予最-高推荐临床剂量后,所有药物(结合和未结合)的平均稳态Cmax值;Ki是抑制常数。

目前推荐根据[I]/Ki可以预测体内相互作用的可能性,比值升高,产生相互作用的可能性增大[13],见表4。

尽管通过体外数据定量预测体内相互作用发生的可能性存在困难,但可以通过同一个药物对不同CYP 酶(CYP1A2, CYP2C8, CYP2C9,CYP2C19,CYP2D6和CYP3A)的[I]/Ki值进行筛选排序。

采用最大[I]/Ki比值的CYP开展体内研究,如果该CYP显示无体内相互作用,则无需进行其他CYP体内评价研究。

对于CYP3A的抑制剂,建议评价2个结构不相关的底物,如果其中一个显示有潜在相互作用,则应进行体内评价。

5.3 确定受试药物是否是基于作用机制抑制剂

体外实验还应进行时间依赖抑制筛查,建议加入底物前,对潜在抑制剂进行30min预培养,起始产物形成率的所有时间依赖性及浓度依赖性损失均表明为作用机制性抑制[14]。

6

确定受试药物是否是肝微粒体P450酶的诱导剂

6.1 实验设计注意事项

(1)受试药物的浓度应该参考临床治疗剂量的血药浓度,至少包括3个涵盖治疗窗的筛选浓度,其中至少1个浓度要超过平均预测血药浓度1个数量级。

(2)与完整的单层肝细胞或分离的微粒体共孵育2~3d后,通过CYP特异的探针底物(见表3),参照“5.1”项实验条件测定酶活性。

(3)应包括一个公认的酶诱导剂[12] (见表5)作为阳性对照,来减小不同供体酶催化活性差异引起的误差。

6.2 酶诱导终点预测

受试药物体外实验引起的酶活性的改变≥40%阳性对照结果时,可以认为药物具有酶诱导作用,需要进一步的体内研究。

根据目前了解的CYP酶诱导的细胞学机制,如果一个诱导实验显示CYP3A4酶没有诱导作用,可以推断此药物对CYP2C8,CYP2C9和CYP2C19也没有诱导作用[15]。

6.3 其他方法

除直接测定酶活性方法外,还有一些其他的方法确定诱导性。应用特异性的多克隆抗体进行WesternBlotting对酶进行定量,该方法需要解决电泳技术对不同CYP酶的完全分离问题和抗体对CYP酶的特异性问题。应用RT-PCR 技术测定细胞内特定酶的mRNA表达水平,但有时mRNA的表达水平与酶活性的关系不能确定, 但是当酶诱导作用(mRNA水平上调)和酶抑制作用(酶活性下调)同时存在时,mRNA的测定是有益的。对于受体介导的CYP酶诱导作用可以采用受体基因测定的方法,细胞表面受体介导的CYP1A,CYP2B和CYP3A 酶诱导作用已经被确认,已经开发了高通量AhG (芳烃受体)和PXR (孕甾烷X受体)结合测定和细胞受体基因测定法,并用于筛选具有CYP1A和CYP3A诱导可能性的化合物。

参考文献

文章来源:中国药事2013年第27卷第1期

 

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Ⅱ相代谢稳定性试剂盒
CYP450酶代谢表型研究试剂盒
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CYP450酶,标准品,孵育系统等

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空白血浆:食蟹猴,恒河猴,比格犬,大鼠,小鼠,猪,兔
空白血:食蟹猴,恒河猴,比格犬,大鼠,小鼠,猪,兔
空白尿液:食蟹猴,恒河猴,比格犬,大鼠,小鼠

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